परंपरागत नेस्टेड और रीयल-टाइम पीसीआर assays के बीच महत्वपूर्ण अंतर यह है कि पारंपरिक पीसीआर डीएनए के विशिष्ट अनुक्रमों को बढ़ाने के लिए विकसित एक तकनीक है और नेस्टेड पीसीआर पारंपरिक पीसीआर का एक संशोधन है जिसमें दो अनुक्रमिक प्रवर्धन प्रतिक्रियाएं होती हैं, जबकि वास्तविक -टाइम पीसीआर पारंपरिक पीसीआर का एक प्रकार है जो प्रवर्धित उत्पाद की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम है।
पीसीआर डीएनए का पता लगाने के लिए अनुसंधान और चिकित्सा में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली एक बहुत ही सामान्य वैज्ञानिक तकनीक है। पीसीआर परीक्षणों का उपयोग उनके डीएनए या आरएनए का पता लगाकर एंटीजन का पता लगाने के लिए किया जाता है। आमतौर पर वायरल आरएनए एंटीबॉडी का पता लगाने या बीमारी के लक्षण प्रदर्शित करने से पहले शरीर में मौजूद होता है।एक पीसीआर परीक्षण बता सकता है कि किसी को वायरस है या नहीं। वर्तमान में, पीसीआर COVID-19 बीमारी का पता लगाने के लिए मानक परीक्षण है। विभिन्न प्रकार की पीसीआर तकनीकें हैं जैसे रीयल-टाइम पीसीआर, नेस्टेड पीसीआर, मल्टीप्लेक्स पीसीआर, हॉट स्टार्ट पीसीआर और लंबी दूरी की पीसीआर, आदि।
पारंपरिक पीसीआर परख क्या हैं?
पारंपरिक पीसीआर परख एक इन विट्रो डीएनए प्रवर्धन तकनीक है जो नियमित रूप से आणविक जैविक प्रयोगशालाओं में की जाती है। इस पद्धति ने एक विशेष डीएनए टुकड़े की हजारों से लाखों प्रतियों के उत्पादन को सक्षम किया। कैरी मुलिस ने इस तकनीक को 1980 में पेश किया था। इस तकनीक की कई प्रतियां बनाने के लिए एक डीएनए टुकड़े की आवश्यकता होती है जिसे टेम्पलेट के रूप में जाना जाता है। टाक पोलीमरेज़ डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम के रूप में काम करता है और टेम्पलेट अनुक्रम के नए स्ट्रैंड के संश्लेषण को उत्प्रेरित करता है।
पीसीआर मिश्रण में प्राइमर फ्रैगमेंट एक्सटेंशन के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में काम करेंगे। डीएनए की प्रतियां बनाने के लिए आवश्यक सभी सामग्री पीसीआर मिश्रण में शामिल हैं।पीसीआर प्रतिक्रिया एक पीसीआर मशीन में चलाई जाती है, और इसे सही पीसीआर मिश्रण और सही पीसीआर प्रोग्राम के साथ खिलाया जाना चाहिए। यदि प्रतिक्रिया मिश्रण और कार्यक्रम सही हैं, तो यह बहुत कम मात्रा में डीएनए से डीएनए के एक विशेष खंड की आवश्यक संख्या में प्रतियां तैयार करेगा।
चित्रा 01: पारंपरिक पीसीआर परख
एक पीसीआर प्रतिक्रिया में तीन प्रमुख चरण शामिल होते हैं: विकृतीकरण, प्राइमर एनीलिंग और स्ट्रैंड एक्सटेंशन। ये तीन चरण तीन अलग-अलग तापमानों पर होते हैं। पीसीआर बफर टाक पोलीमरेज़ कार्रवाई के लिए इष्टतम स्थितियों को बनाए रखता है। पीसीआर उत्पाद की आवश्यक मात्रा का उत्पादन करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया के इन तीन चरणों को दोहराया जाता है। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में, डीएनए प्रतियों की संख्या दोगुनी हो जाती है।इसलिए, पीसीआर में घातीय प्रवर्धन देखा जा सकता है। पीसीआर उत्पाद को जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके हल किया जा सकता है क्योंकि यह एक जेल पर डीएनए की एक दृश्यमान मात्रा का उत्पादन करता है, और इसे आगे के अध्ययन जैसे अनुक्रमण के लिए शुद्ध किया जा सकता है।
पीसीआर चिकित्सा और जैविक अनुसंधान में एक मूल्यवान उपकरण है। विशेष रूप से फोरेंसिक अध्ययनों में, पीसीआर का बहुत महत्व है क्योंकि यह अपराधियों के छोटे नमूनों से अध्ययन के लिए डीएनए को बढ़ा सकता है और फोरेंसिक डीएनए प्रोफाइल बना सकता है। पीसीआर का व्यापक रूप से आणविक जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है, जिसमें जीनोटाइपिंग, जीन क्लोनिंग, म्यूटेशन डिटेक्शन, डीएनए सीक्वेंसिंग, डीएनए माइक्रोएरे और पितृत्व परीक्षण शामिल हैं।
नेस्टेड पीसीआर परख क्या हैं?
नेस्टेड पीसीआर एक प्रकार का पीसीआर है जो डीएनए के गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को कम करता है। नेस्टेड पीसीआर परख में लगातार दो पीसीआर या दो अनुक्रमिक प्रवर्धन प्रतिक्रियाएं होती हैं। पहली प्रवर्धन प्रतिक्रिया के दौरान, एक पीसीआर उत्पाद का उत्पादन किया जाता है। पहली प्रतिक्रिया के बाद, पहली प्रतिक्रिया के पीसीआर उत्पाद पर दूसरी प्रवर्धन प्रतिक्रिया की जाती है।इसलिए, दूसरे प्रतिक्रिया मिश्रण में प्राइमर पहले पीसीआर उत्पाद के साथ बंधते हैं और इसे बढ़ाते हैं।
चित्र 02: नेस्टेड पीसीआर
प्राइमर जोड़े प्रत्येक प्रतिक्रिया में भिन्न होते हैं। नेस्टेड पीसीआर में प्राइमरों का गैर-विशिष्ट बंधन कम हो जाता है। नेस्टेड पीसीआर परख संवेदनशीलता और/या विशिष्टता को बढ़ाने के लिए उपयोगी हैं। हालांकि, नेस्टेड पीसीआर को रुचि अनुक्रम के बारे में ज्ञान की आवश्यकता है।
रियल-टाइम पीसीआर एसेज़ क्या हैं?
रियल-टाइम पीसीआर या क्वांटिटेटिव पीसीआर (क्यू पीसीआर) पीसीआर का एक संशोधित संस्करण है जो पीसीआर उत्पादों को मात्रात्मक रूप से मापता है। इसलिए, यह तकनीक रीयल-टाइम पीसीआर मशीन का उपयोग करके रीयल-टाइम में प्रवर्धन की मात्रा निर्धारित करती है। यह एक नमूने में मौजूद लक्ष्य अनुक्रम या जीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए भी एक उपयुक्त तरीका है।
रीयल-टाइम पीसीआर की दिलचस्प विशेषता यह है कि यह प्रवर्धन और वास्तविक परिमाणीकरण दोनों को एक ही चरण में जोड़ती है। इसलिए, वास्तविक समय पीसीआर तकनीक द्वारा पता लगाने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन की आवश्यकता को समाप्त किया जा सकता है। पीसीआर प्रतिक्रियाओं के दौरान पीसीआर उत्पादों को लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग से अंततः प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव होगा। जब पीसीआर उत्पाद जमा होते हैं, तो फ्लोरोसेंट सिग्नल भी जमा होते हैं, और उन्हें रीयल-टाइम मशीन द्वारा मापा जाएगा। SYBR ग्रीन और ताकमान रीयल-टाइम पीसीआर की प्रवर्धन प्रक्रिया का पता लगाने या देखने के दो तरीके हैं। दोनों विधियां प्रवर्धन प्रक्रिया की प्रगति की निगरानी करती हैं और वास्तविक समय में उत्पाद की मात्रा की रिपोर्ट करती हैं।
चित्र 03: रीयल-टाइम पीसीआर
रीयल-टाइम पीसीआर में जीन एक्सप्रेशन क्वांटिफिकेशन, माइक्रोआरएनए और नॉन-कोडिंग आरएनए विश्लेषण, एसएनपी जीनोटाइपिंग, कॉपी नंबर वेरिएंट का पता लगाना, दुर्लभ म्यूटेशन का पता लगाना, आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों का पता लगाना, और जैसे अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता है। संक्रामक एजेंटों का पता लगाना।
पारंपरिक नेस्टेड और रीयल-टाइम पीसीआर एसेज़ के बीच समानताएं क्या हैं?
- नेस्टेड और रीयल-टाइम पीसीआर परख पारंपरिक पीसीआर परख के संशोधन हैं।
- तीनों तकनीक डीएनए नमूनों को बढ़ाती हैं।
- उनके उत्पादों का उपयोग अनुक्रमण या विश्लेषण में किया जा सकता है।
- इन परखों के लिए प्राइमर की आवश्यकता होती है।
पारंपरिक नेस्टेड और रीयल-टाइम पीसीआर एसेज़ में क्या अंतर है?
पारंपरिक पीसीआर डीएनए के विशिष्ट अनुक्रमों को बढ़ाने के लिए विकसित एक तकनीक है। इस बीच, नेस्टेड पीसीआर पारंपरिक पीसीआर का एक संशोधन है जिसमें दो अनुक्रमिक प्रवर्धन प्रतिक्रियाएं होती हैं, और वास्तविक समय पीसीआर पारंपरिक पीसीआर का एक प्रकार है जो प्रवर्धित उत्पाद की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम है।तो, यह पारंपरिक नेस्टेड और रीयल-टाइम पीसीआर assays के बीच महत्वपूर्ण अंतर है। पारंपरिक और रीयल-टाइम पीसीआर के विपरीत, नेस्टेड पीसीआर दो प्राइमर सेट का उपयोग करता है। इसके अलावा, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को कम करने के लिए नेस्टेड पीसीआर में लगातार दो प्रवर्धन प्रतिक्रियाएं होती हैं। इसके अलावा, पारंपरिक और वास्तविक समय पीसीआर परख में दो अनुक्रमिक प्रवर्धन प्रतिक्रियाएं नहीं होती हैं।
निम्नलिखित इन्फोग्राफिक पारंपरिक नेस्टेड और रीयल-टाइम पीसीआर assays के बीच अंतर को सारणीबद्ध रूप में साथ-साथ तुलना के लिए सूचीबद्ध करता है।
सारांश - पारंपरिक बनाम नेस्टेड बनाम रीयल-टाइम पीसीआर परख
पारंपरिक पीसीआर डीएनए के विशिष्ट अंशों को बढ़ाने के लिए विकसित पहली तकनीक है। नेस्टेड पीसीआर और रीयल-टाइम पीसीआर पारंपरिक पीसीआर के दो प्रकार हैं। नेस्टेड पीसीआर में दो अनुक्रमिक प्रवर्धन प्रतिक्रियाएं और दो प्राइमर सेट का उपयोग होता है। वास्तविक समय पीसीआर को प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया है। इस प्रकार, यह पारंपरिक नेस्टेड और रीयल-टाइम पीसीआर assays के बीच अंतर को सारांशित करता है।
