मुख्य अंतर – उत्तरी बनाम दक्षिणी बनाम पश्चिमी सोख्ता
आणविक जीव विज्ञान में विभिन्न प्रकार के अध्ययनों के लिए डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के विशिष्ट अनुक्रमों का पता लगाना आवश्यक है। जेल वैद्युतकणसंचलन एक ऐसी तकनीक है जो डीएनए, आरएनए और प्रोटीन को उनके आकार के अनुसार अलग करती है। जेल प्रोफाइल से, विशेष रूप से डीएनए अनुक्रम, आरएनए अनुक्रम, या प्रोटीन का पता विशेष तकनीकों द्वारा लगाया जाता है जिसे ब्लॉटिंग और लेबल वाले जांच के साथ संकरण कहा जाता है। तीन अलग-अलग प्रकार की सोख्ता विधियाँ हैं, अर्थात् दक्षिणी, उत्तरी और पश्चिमी। उत्तरी दक्षिणी और पश्चिमी सोख्ता के बीच महत्वपूर्ण अंतर यह है कि यह एक नमूने से किस प्रकार के अणु का पता लगाता है।दक्षिणी सोख्ता एक ऐसी विधि है जो डीएनए नमूने से एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम का पता लगाती है। उत्तरी सोख्ता एक ऐसी तकनीक है जो आरएनए नमूने से एक विशिष्ट आरएनए अनुक्रम का पता लगाती है। वेस्टर्न ब्लॉटिंग एक ऐसी विधि है जो प्रोटीन के नमूने से एक विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाती है।
दक्षिणी सोख्ता क्या है?
दक्षिणी सोख्ता तकनीक ई.एम. सदर्न द्वारा 1975 में एक डीएनए नमूने से एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम की पहचान के लिए विकसित की गई थी। यह आणविक जीव विज्ञान में पेश की गई पहली सोख्ता तकनीक है। इसने डीएनए से विशिष्ट जीन, डीएनए से विशिष्ट अंश आदि का पता लगाने में सक्षम बनाया। दक्षिणी सोख्ता तकनीक में कई चरण शामिल हैं। वे इस प्रकार हैं।
- डीएनए को नमूने से अलग किया जाता है और प्रतिबंध एंडोन्यूक्लाइजेस के साथ पचाया जाता है।
- पचा हुआ नमूना एग्रोज जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है।
- जेल में डीएनए के टुकड़े एक क्षारीय घोल के उपयोग से एकल किस्में में विकृत हो जाते हैं।
- एकल फंसे डीएनए को केशिका स्थानांतरण द्वारा नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्टर झिल्ली में स्थानांतरित किया जाता है।
- स्थानांतरित डीएनए स्थायी रूप से झिल्ली पर तय हो जाता है।
- झिल्ली पर स्थिर डीएनए लेबल वाली जांच के साथ संकरणित होता है।
- झिल्ली से अनबाउंड डीएनए धोने से धुल जाता है।
- एक्स-रे फिल्म झिल्ली के संपर्क में आती है और एक ऑटोरेडियोग्राफ़ तैयार किया जाता है।
आणविक जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं के लिए दक्षिणी सोख्ता लागू किया जाता है। यह आरएफएलपी मैपिंग, फोरेंसिक अध्ययन, जीन अभिव्यक्ति में डीएनए मिथाइलेशन, आनुवंशिक विकारों में उत्परिवर्तित जीन का पता लगाने, डीएनए फिंगरप्रिंटिंग आदि में उपयोगी है।
चित्र 01: दक्षिणी सोख्ता तकनीक
उत्तरी धब्बा क्या है?
उत्तरी सोख्ता एक विधि है जिसे जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक नमूने से एक विशिष्ट आरएनए अनुक्रम या एमआरएनए अनुक्रम का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस तकनीक को 1979 में एल्विन, केम्प और स्टार्क द्वारा विकसित किया गया था। यह कई चरणों के कारण दक्षिणी और पश्चिमी सोख्ता तकनीकों से अलग है। हालांकि, इस तकनीक को जेल वैद्युतकणसंचलन, सोख्ता, और विशिष्ट लेबल जांच और पहचान के साथ संकरण के माध्यम से भी किया जाता है। उत्तरी सोख्ता तकनीक इस प्रकार की जाती है।
- आरएनए नमूने से निकाला जाता है और जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है।
- आरएनए को जेल से एक सोख्ता झिल्ली पर स्थानांतरित किया जाता है और स्थिर किया जाता है।
- झिल्ली को सीडीएनए या आरएनए से तैयार एक लेबल जांच के साथ इलाज किया जाता है (जांच नमूने में एक विशिष्ट अनुक्रम का पूरक है)।
- जांच एक विशिष्ट अनुक्रम के साथ बाँधने के लिए झिल्ली के साथ इनक्यूबेट किया जाता है।
- अनबाउंड जांच धुल जाती है।
- हाइब्रिडाइज़्ड अंशों का पता ऑटोरेडियोग्राफ़ द्वारा लगाया जाता है।
उत्तरी सोख्ता संकरित एमआरएनए का पता लगाने और मात्रा का ठहराव, आरएनए क्षरण का अध्ययन, आरएनए अर्ध-जीवन का मूल्यांकन, आरएनए स्प्लिसिंग का पता लगाने, जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने आदि में एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
चित्र 02: उत्तरी धब्बा
वेस्टर्न ब्लॉटिंग क्या है?
पश्चिमी सोख्ता लेबल एंटीबॉडी के उपयोग से एक प्रोटीन मिश्रण से एक विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने की एक विधि है। इसलिए, पश्चिमी धब्बा को इम्युनोब्लॉट के रूप में भी जाना जाता है। इस तकनीक को 1979 में टॉबिन एट अल द्वारा पेश किया गया था और अब इसे नियमित रूप से प्रोटीन विश्लेषण के लिए प्रयोगशालाओं में किया जाता है। कदम इस प्रकार हैं।
- नमूने से प्रोटीन निकाला जाता है
- पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके प्रोटीन को उनके आकार से अलग किया जाता है
- अलग किए गए अणुओं को इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा पीवीडीएफ झिल्ली या नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित किया जाता है
- प्रतिरक्षी के साथ गैर-विशिष्ट बंधन के लिए झिल्ली अवरुद्ध है
- स्थानांतरित प्रोटीन प्राथमिक एंटीबॉडी (एंजाइम लेबल एंटीबॉडी) से बंधे होते हैं।
- गैर-विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए झिल्ली को धोया जाता है
- बाध्य एंटीबॉडी का पता सब्सट्रेट जोड़कर और बनने वाले रंगीन अवक्षेप का पता लगाकर लगाया जाता है
वेस्टर्न ब्लॉटिंग मानव सीरम के नमूने में एंटी-एचआईवी एंटीबॉडी का पता लगाने में उपयोगी है। पश्चिमी धब्बा का उपयोग हेपेटाइटिस बी संक्रमण के लिए पुष्टिकरण परीक्षण और पागल गाय रोग के लिए निश्चित परीक्षण के रूप में भी किया जा सकता है।
चित्र 03: वेस्टर्न ब्लॉटिंग
उत्तरी दक्षिणी और पश्चिमी धब्बा में क्या अंतर है?
उत्तरी बनाम दक्षिणी बनाम पश्चिमी धब्बा |
|
| अणु के प्रकार का पता चला | |
| उत्तरी धब्बा | उत्तरी सोख्ता एक आरएनए नमूने से एक विशिष्ट आरएनए अनुक्रम का पता लगाता है। |
| दक्षिणी धब्बा | दक्षिणी सोख्ता डीएनए नमूने से एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम का पता लगाता है। |
| वेस्टर्न ब्लॉटिंग | पश्चिमी सोख्ता एक प्रोटीन नमूने से एक विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाता है। |
| जेल का प्रकार | |
| उत्तरी धब्बा | इसमें अगारोज/फॉर्मेल्डिहाइड जेल का उपयोग किया जाता है। |
| दक्षिणी धब्बा | इसमें Agarose gel का उपयोग किया जाता है। |
| वेस्टर्न ब्लॉटिंग | इसमें पॉलीएक्रिलामाइड जेल का उपयोग किया जाता है। |
| ब्लॉटिंग विधि | |
| उत्तरी धब्बा | यह एक केशिका स्थानांतरण है। |
| दक्षिणी धब्बा | यह एक केशिका स्थानांतरण है। |
| वेस्टर्न ब्लॉटिंग | यह एक इलेक्ट्रिक ट्रांसफर है। |
| प्रयुक्त जांच | |
| उत्तरी धब्बा | cDNA या RNA जांच को रेडियोधर्मी या गैर-रेडियोधर्मी रूप से लेबल किया जाता है। |
| दक्षिणी धब्बा | डीएनए जांच को रेडियोधर्मी या गैर-रेडियोधर्मी रूप से लेबल किया जाता है। |
| वेस्टर्न ब्लॉटिंग | प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग जांच के रूप में किया जाता है। |
| पहचान प्रणाली | |
| उत्तरी धब्बा | यह एक ऑटोरेडियोग्राफ़ का उपयोग करके किया जाता है, या प्रकाश या रंग परिवर्तन का पता लगाता है। |
| दक्षिणी धब्बा | यह एक ऑटोरेडियोग्राफ़, प्रकाश या रंग परिवर्तन का पता लगाने का उपयोग करके किया जाता है। |
| वेस्टर्न ब्लॉटिंग | यह प्रकाश या रंग परिवर्तन का पता लगाकर किया जाता है। |
सारांश – उत्तरी बनाम दक्षिणी बनाम पश्चिमी धब्बा
ब्लॉटिंग एक विशेष तकनीक है जिसे नमूनों से विशिष्ट डीएनए, आरएनए या प्रोटीन की पहचान के लिए विकसित किया गया है।एक विशिष्ट प्रकार के अणु का पता लगाने के लिए, तीन अलग-अलग सोख्ता प्रक्रियाएं हैं, अर्थात् उत्तरी, दक्षिणी और पश्चिमी। उत्तरी सोख्ता तकनीक को आरएनए के मिश्रण से एक विशिष्ट आरएनए अनुक्रम का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। दक्षिणी सोख्ता तकनीक एक डीएनए नमूने से एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम का पता लगाने में सक्षम बनाती है और एक प्रोटीन मिश्रण से एक विशिष्ट प्रोटीन की पहचान करने के लिए पश्चिमी सोख्ता तकनीक विकसित की जाती है।
