मुख्य अंतर - एनजीएस बनाम सेंगर सीक्वेंसिंग
नेक्स्ट जेनरेशन सीक्वेंसिंग (एनजीएस) और सेंगर सीक्वेंसिंग समय के साथ विकसित दो प्रकार की न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमण तकनीकें हैं। सेंगर अनुक्रमण पद्धति का व्यापक रूप से कई वर्षों तक उपयोग किया गया था और एनजीएस ने हाल ही में इसके फायदे के कारण इसे बदल दिया। एनजीएस और सेंगर सीक्वेंसिंग के बीच महत्वपूर्ण अंतर यह है कि एनजीएस एक सीक्वेंसिंग सिस्टम के माध्यम से एक साथ लाखों सीक्वेंस को तेजी से सीक्वेंस करने के सिद्धांत पर काम करता है, जबकि सेंगर सीक्वेंसिंग डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम द्वारा डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स के चयनात्मक समावेश के कारण चेन टर्मिनेशन के प्रिंसिपल पर काम करता है। डीएनए प्रतिकृति के दौरान और केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा खंड पृथक्करण के परिणामस्वरूप।
न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमण क्या है?
आनुवंशिक जानकारी किसी जीव के डीएनए या आरएनए के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों में संग्रहीत होती है। किसी दिए गए टुकड़े (एक जीन, जीन के समूह, गुणसूत्र, और पूर्ण जीनोम में) में न्यूक्लियोटाइड्स (चार आधारों का उपयोग करके) के सही क्रम को निर्धारित करने की प्रक्रिया को न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमण के रूप में जाना जाता है। यह जीनोमिक अध्ययन, फोरेंसिक अध्ययन, वायरोलॉजी, जैविक व्यवस्थित, चिकित्सा निदान, जैव प्रौद्योगिकी और कई अन्य क्षेत्रों में जीन की संरचना और कार्य का विश्लेषण करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। वैज्ञानिकों द्वारा विकसित विभिन्न प्रकार की अनुक्रमण विधियां हैं। उनमें से, 1977 में फ्रेडरिक सेंगर द्वारा विकसित सेंगर अनुक्रमण का व्यापक रूप से उपयोग किया गया और लंबे समय तक लोकप्रिय रहा जब तक कि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण ने इसे प्रतिस्थापित नहीं कर दिया।
एनजीएस क्या है?
नेक्स्ट जेनरेशन सीक्वेंसिंग (एनजीएस) एक शब्द है जिसका इस्तेमाल आधुनिक हाई थ्रूपुट सीक्वेंसिंग प्रक्रियाओं के लिए किया जाता है। यह कई विभिन्न आधुनिक अनुक्रमण तकनीकों का वर्णन करता है जिन्होंने जीनोमिक अध्ययन और आण्विक जीवविज्ञान में क्रांतिकारी बदलाव किया।वे तकनीकें हैं इलुमिना अनुक्रमण, रोश 454 अनुक्रमण, आयन प्रोटॉन अनुक्रमण और एसओएलआईडी (ओलिगो लिगेशन डिटेक्शन द्वारा अनुक्रमण) अनुक्रमण। एनजीएस सिस्टम तेज और सस्ता है। एनजीएस प्रणालियों में चार मुख्य डीएनए अनुक्रमण विधियों का उपयोग किया जाता है; पाइरोडिंग, संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण, बंधाव द्वारा अनुक्रमण और आयन अर्धचालक अनुक्रमण। बड़ी संख्या में डीएनए या आरएनए स्ट्रैंड (लाखों) को समानांतर रूप से अनुक्रमित किया जा सकता है। यह सेंगर अनुक्रमण के विपरीत, जिसमें अधिक समय लगता है, थोड़े समय के भीतर जीवों के पूरे जीनोम के अनुक्रमण की अनुमति देता है।
एनजीएस के पारंपरिक अनुक्रमण सेंगर पद्धति की तुलना में कई फायदे हैं। यह एक उच्च गति, अधिक सटीक और लागत प्रभावी प्रक्रिया है जिसे छोटे नमूने के आकार के साथ किया जा सकता है। एनजीएस का उपयोग मेटागेनोमिक अध्ययनों में, सम्मिलन और विलोपन आदि के कारण एक व्यक्तिगत जीनोम के भीतर भिन्नता का पता लगाने और जीन अभिव्यक्तियों के विश्लेषण में किया जा सकता है।
चित्र_1: एनजीएस अनुक्रमण में विकास
सेंगर सीक्वेंसिंग क्या है?
सेंगर सीक्वेंसिंग एक अनुक्रमण विधि है जिसे 1977 में फ्रेडरिक सेंगर और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित डीएनए टुकड़े के सटीक न्यूक्लियोटाइड क्रम को निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया था। इसे चेन टर्मिनेशन सीक्वेंसिंग या डाइडॉक्सी सीक्वेंसिंग के रूप में भी जाना जाता है। इस पद्धति का कार्य सिद्धांत डीएनए की प्रतिकृति के दौरान डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा डीडीजीटीपी, डीडीसीटीपी, डीडीएटीपी और डीडीटीटीपी जैसे डीडीजीटीपी, डीडीसीटीपी और डीडीटीटीपी को समाप्त करने वाली एक श्रृंखला के चयनात्मक समावेश द्वारा स्ट्रैंड संश्लेषण की समाप्ति है। सामान्य न्यूक्लियोटाइड्स में 3' OH समूह होते हैं, जो स्ट्रैंड के गठन को जारी रखने के लिए आसन्न न्यूक्लियोटाइड्स के बीच फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड के निर्माण के लिए होते हैं। हालांकि, ddNTPs में इस 3' OH समूह की कमी होती है और वे न्यूक्लियोटाइड्स के बीच फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड बनाने में असमर्थ होते हैं। इसलिए, श्रृंखला बढ़ाव समाप्त हो गया है।
इस विधि में, अनुक्रमित किया जाने वाला एकल-फंसे डीएनए इन विट्रो डीएनए संश्लेषण के लिए टेम्पलेट स्ट्रैंड के रूप में कार्य करता है।अन्य आवश्यकताएं ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर, डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड अग्रदूत और डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम हैं। जब लक्ष्य के टुकड़े के किनारे के छोर ज्ञात होते हैं, तो प्राइमरों को आसानी से डीएनए प्रतिकृति के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। चार अलग-अलग डीएनए संश्लेषण प्रतिक्रियाएं चार अलग-अलग ट्यूबों में की जाती हैं। प्रत्येक ट्यूब में अन्य आवश्यकताओं के साथ अलग-अलग ddNTPs होते हैं। विशेष न्यूक्लियोटाइड से, dNTPs और ddNTPs का मिश्रण जोड़ा जाता है। इसी तरह, चार मिश्रणों के साथ चार ट्यूबों में चार अलग-अलग प्रतिक्रियाएं की जाती हैं। प्रतिक्रियाओं के बाद, डीएनए अंशों का पता लगाने और खंड पैटर्न को अनुक्रम जानकारी में बदलने का कार्य किया जाता है। परिणामी डीएनए अंशों को जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा गर्मी विकृत और अलग किया जाता है। यदि रेडियोधर्मी न्यूक्लियोटाइड का उपयोग किया जाता है, तो पॉलीएक्रिलामाइड जेल में बैंडिंग पैटर्न को ऑटोरैडियोग्राफी द्वारा देखा जा सकता है। जब यह विधि फ्लोरोसेंटली टैग किए गए डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करती है, तो इसे फ्लोरोसेंट डिटेक्टर द्वारा पता लगाने के लिए लेजर के बीम के माध्यम से पढ़े जाने वाले जेल को कम किया जा सकता है और पारित किया जा सकता है।किसी अनुक्रम को आँख से पढ़ने और कंप्यूटर में मैन्युअल रूप से प्रवेश करने पर उत्पन्न होने वाली त्रुटियों से बचने के लिए, इस पद्धति को कंप्यूटर के साथ युग्मित स्वचालित अनुक्रमक के उपयोग में विकसित किया गया।
ह्यूमन जीनोम प्रोजेक्ट से डीएनए को अनुक्रमित करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली यह विधि है। यह विधि अभी भी उन्नत संशोधनों के साथ प्रयोग में है क्योंकि यह एक महंगी और धीमी प्रक्रिया होने के बावजूद सटीक अनुक्रम जानकारी देती है।
चित्र_2: सेंगर अनुक्रमण
एनजीएस और सेंगर सीक्वेंसिंग में क्या अंतर है?
एनजीएस बनाम सेंगर सीक्वेंसिंग |
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| अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) आधुनिक उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण प्रक्रियाओं को संदर्भित करता है। यह कई विभिन्न आधुनिक अनुक्रमण तकनीकों का वर्णन करता है | सेंगर सीक्वेंसिंग एक अनुक्रमण विधि है जिसे फ्रेडरिक सेंगर द्वारा विकसित डीएनए खंड के सटीक न्यूक्लियोटाइड क्रम को निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया है। |
| लागत प्रभावशीलता | |
| एनजीएस एक सस्ती प्रक्रिया है क्योंकि यह समय, मानव शक्ति और रसायनों को कम करती है। | यह एक महंगी प्रक्रिया है क्योंकि इसमें समय, मानव शक्ति और अधिक रसायन लगते हैं। |
| गति | |
| यह तेज है क्योंकि रासायनिक पहचान और कई किस्में के सिग्नल का पता लगाने दोनों समानांतर हो रहे हैं। | यह समय लेने वाली है क्योंकि रासायनिक पहचान और सिग्नल का पता लगाना दो अलग-अलग प्रक्रियाओं के रूप में होता है और एक समय में केवल स्ट्रैंड पर ही पढ़ा जा सकता है। |
| विश्वसनीयता | |
| NGS विश्वसनीय है। | सेंगर अनुक्रमण कम विश्वसनीय है |
| नमूना आकार | |
| NGS को कम मात्रा में DNA की आवश्यकता होती है। | इस विधि के लिए बड़ी मात्रा में टेम्प्लेट डीएनए की आवश्यकता होती है। |
| डीएनए बेस प्रति अनुक्रमित टुकड़े | |
| प्रति अनुक्रमित टुकड़े में डीएनए बेस की संख्या सेंगर विधि से कम है | एनजीएस अनुक्रमों की तुलना में अनुक्रम उत्पन्न करना लंबा है। |
सारांश - एनजीएस बनाम सेंगर सीक्वेंसिंग
एनजीएस और सेंगर सीक्वेंसिंग न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमण तकनीक हैं जिनका व्यापक रूप से आणविक जीव विज्ञान में उपयोग किया जाता है। सेंगर अनुक्रमण एक प्रारंभिक अनुक्रमण विधि है जिसे एनजीएस द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। एनजीएस और सेंगर सीक्वेंसिंग के बीच मुख्य अंतर यह है कि एनजीएस सेंगर सीक्वेंसिंग की तुलना में एक उच्च गति, अधिक सटीक और लागत प्रभावी प्रक्रिया है।दोनों तकनीकों ने जेनेटिक्स और बायोटेक्नोलॉजी में प्रमुख प्रकोप पैदा किए।
