मुख्य अंतर - सेंगर सीक्वेंसिंग बनाम पायरोइडेंसिंग
डीएनए विश्लेषण के लिए डीएनए अनुक्रमण बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि किसी विशेष डीएनए क्षेत्र पर सही न्यूक्लियोटाइड व्यवस्था के ज्ञान से इसके बारे में कई महत्वपूर्ण जानकारी का पता चलता है। विभिन्न डीएनए अनुक्रमण विधियां हैं। सेंगर अनुक्रमण और पाइरोडिंग दो अलग-अलग डीएनए अनुक्रमण विधियां हैं जिनका व्यापक रूप से आणविक जीव विज्ञान में उपयोग किया जाता है। सेंगर अनुक्रमण और पाइरोडिंग के बीच महत्वपूर्ण अंतर यह है कि सेंगर अनुक्रमण न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को पढ़ने के लिए डीएनए के संश्लेषण को समाप्त करने के लिए डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करता है, जबकि पाइरोग्रेडिंग न्यूक्लियोटाइड को शामिल करके और अनुक्रम के सटीक क्रम को पढ़ने के लिए पूरक अनुक्रम को संश्लेषित करके पाइरोफॉस्फेट रिलीज का पता लगाता है।
सेंगर सीक्वेंसिंग क्या है?
सेंगर अनुक्रमण पहली पीढ़ी की डीएनए अनुक्रमण विधि है जिसे 1977 में फ्रेडरिक सेंगर और उनके कॉलेजों द्वारा विकसित किया गया था। इसे चेन टर्मिनेशन सीक्वेंसिंग या डाइडॉक्सी अनुक्रमण के रूप में भी जाना जाता है क्योंकि यह डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स (डीडीएनटीपी) द्वारा श्रृंखला समाप्ति पर आधारित है। नई पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) विकसित होने तक इस पद्धति का व्यापक रूप से 30 से अधिक वर्षों तक उपयोग किया गया था। सेंगर अनुक्रमण तकनीक ने सही न्यूक्लियोटाइड क्रम की खोज या किसी विशेष डीएनए टुकड़े के लगाव को सक्षम किया। यह इन विट्रो डीएनए प्रतिकृति के दौरान ddNTPs के चयनात्मक समावेश और डीएनए संश्लेषण की समाप्ति पर आधारित है। आसन्न न्यूक्लियोटाइड्स के बीच फॉस्फोडाइस्टर बांड गठन को जारी रखने के लिए 3 'ओएच समूहों की अनुपस्थिति ddNTPs की एक अनूठी विशेषता है। इसलिए, एक बार ddNTP संलग्न हो जाने पर, श्रृंखला बढ़ाव समाप्त हो जाता है और उस बिंदु से समाप्त हो जाता है। सेंगर अनुक्रमण में चार ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP और ddTTP - का उपयोग किया जाता है। ये न्यूक्लियोटाइड डीएनए प्रतिकृति प्रक्रिया को रोकते हैं जब उन्हें डीएनए के बढ़ते स्ट्रैंड में शामिल किया जाता है और परिणामस्वरूप छोटे डीएनए की लंबाई अलग-अलग होती है।केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग इन छोटे डीएनए स्ट्रैंड्स को उनके आकार के अनुसार जेल पर व्यवस्थित करने के लिए किया जाता है जैसा कि चित्र 01 में दिखाया गया है।
चित्र 1: संश्लेषित लघु डीएनए की केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन
डीएनए की इन विट्रो प्रतिकृति के लिए, कुछ आवश्यकताओं को प्रदान किया जाना चाहिए। वे डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम, टेम्प्लेट डीएनए, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर और डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड्स (डीएनटीपी) हैं। सेंगर अनुक्रमण में, डीएनए प्रतिकृति चार अलग-अलग टेस्ट ट्यूबों में चार प्रकार के डीडीएनटीपी के साथ अलग-अलग की जाती है। डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड्स को संबंधित ddNTPs द्वारा पूरी तरह से प्रतिस्थापित नहीं किया जाता है। विशेष dNTP (उदाहरण के लिए; dATP + ddATP) का मिश्रण ट्यूब में शामिल किया जाता है और दोहराया जाता है। चार अलग-अलग कुओं में एक जेल पर चार अलग-अलग ट्यूब उत्पाद चलाए जाते हैं। फिर जेल को पढ़कर अनुक्रम का निर्माण किया जा सकता है जैसा कि चित्र 02 में दिखाया गया है।
चित्र 02: सेंगर अनुक्रमण
सेंगर अनुक्रमण एक महत्वपूर्ण तकनीक है जो आणविक जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में मदद करती है। सेंगर अनुक्रमण-आधारित विधियों की सहायता से मानव जीनोम परियोजना को सफलतापूर्वक पूरा किया गया। सेंगर अनुक्रमण लक्ष्य डीएनए अनुक्रमण, कैंसर और आनुवंशिक रोग अनुसंधान, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, मानव पहचान, रोगज़नक़ का पता लगाने, माइक्रोबियल अनुक्रमण आदि में भी उपयोगी है।
सेंगर अनुक्रमण के कई नुकसान हैं:
- अनुक्रमित किए जा रहे डीएनए की लंबाई 1000 बेस पेयर से अधिक नहीं हो सकती
- एक समय में केवल एक ही स्ट्रैंड को अनुक्रमित किया जा सकता है।
- प्रक्रिया समय लेने वाली और महंगी है।
इसलिए, इन समस्याओं को दूर करने के लिए समय के साथ नई उन्नत अनुक्रमण तकनीकों का विकास किया गया। हालांकि, सेंगर अनुक्रमण अभी भी उपयोग में है क्योंकि इसके लगभग 850 बेस जोड़ी लंबाई अंशों तक के अत्यधिक सटीक परिणाम हैं।
पाइरोडिंग क्या है?
पाइरोडिंग एक नई डीएनए अनुक्रमण तकनीक है जो "संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण" पर आधारित है। यह तकनीक न्यूक्लियोटाइड निगमन पर पाइरोफॉस्फेट रिलीज का पता लगाने पर निर्भर करती है। इस प्रक्रिया को चार अलग-अलग एंजाइमों द्वारा नियोजित किया जाता है: डीएनए पोलीमरेज़, एटीपी सल्फ्यूरीलेस, लूसिफ़ेरेज़ और एपिरेज़ और दो सबस्ट्रेट्स एडेनोसिन 5' फ़ॉस्फ़ोसल्फेट (एपीएस) और ल्यूसिफ़ेरिन।
प्रक्रिया एकल-फंसे डीएनए टेम्पलेट के साथ प्राइमर बाइंडिंग के साथ शुरू होती है और डीएनए पोलीमरेज़ इसके पूरक न्यूक्लियोटाइड्स का समावेश शुरू करता है। जब न्यूक्लियोटाइड एक साथ जुड़ते हैं (न्यूक्लिक एसिड पोलीमराइजेशन), तो यह पाइरोफॉस्फेट (एक साथ बंधे दो फॉस्फेट समूह) समूह और ऊर्जा छोड़ता है।प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड जोड़ पाइरोफॉस्फेट की समान मात्रा में रिलीज करता है। सब्सट्रेट एपीएस की उपस्थिति में पायरोफॉस्फेट एटीपी सल्फ्यूरीलेस द्वारा एटीपी में परिवर्तित हो जाता है। उत्पन्न एटीपी ल्यूसिफेरिन के ऑक्सील्यूसिफरिन के ल्यूसिफरेज-मध्यस्थता रूपांतरण को प्रेरित करता है, जो एटीपी की मात्रा के समानुपाती मात्रा में दृश्य प्रकाश का उत्पादन करता है। एक फोटॉन डिटेक्शन डिवाइस या फोटोमल्टीप्लायर द्वारा प्रकाश का पता लगाया जाता है और एक पायरोग्राम बनाता है। Apyrase प्रतिक्रिया मिश्रण में ATP और गैर-निगमित dNTPs को नीचा दिखाता है। dNTP जोड़ एक बार में एक बार किया जाता है। चूंकि न्यूक्लियोटाइड के जोड़ को प्रकाश के समावेश और पता लगाने के अनुसार जाना जाता है, इसलिए टेम्पलेट का क्रम निर्धारित किया जा सकता है। चित्र 03 में दिखाए गए अनुसार नमूना डीएनए के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को उत्पन्न करने के लिए पाइरोग्राम का उपयोग किया जाता है।
एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता विश्लेषण और डीएनए के छोटे हिस्सों के अनुक्रमण में पाइरोडिंग बहुत महत्वपूर्ण है। उच्च सटीकता, लचीलापन, स्वचालन में आसानी और समानांतर प्रसंस्करण, सेंगर अनुक्रमण तकनीकों पर पाइरोडिंग के लाभ हैं।
चित्र 03: पायरोइडेंसिंग
सेंगर सीक्वेंसिंग और पाइरोडिंग में क्या अंतर है?
सेंगर सीक्वेंसिंग बनाम पायरोइडेंसिंग |
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| सेंगर अनुक्रमण एक डीएनए अनुक्रमण विधि है जो डीएनए पोलीमरेज़ और चेन टर्मिनेशन द्वारा ddNTPs के चयनात्मक समावेश पर आधारित है। | पाइरोडिंग एक डीएनए अनुक्रमण विधि है जो न्यूक्लियोटाइड के समावेश पर पाइरोफॉस्फेट रिलीज का पता लगाने पर आधारित है। |
| डीडीएनटीपी का उपयोग | |
| ddNTPs का उपयोग डीएनए प्रतिकृति को समाप्त करने के लिए किया जाता है | ddNTPs का उपयोग नहीं किया जाता है। |
| एंजाइम शामिल हैं | |
| डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग किया जाता है। | चार एंजाइमों का उपयोग किया जाता है: डीएनए पोलीमरेज़, एटीपी सल्फ्यूरीलेस, लूसिफ़ेरेज़ और एपिरेज़। |
| प्रयुक्त सबस्ट्रेट्स | |
| APS और लूसिफ़ेरिन का उपयोग नहीं किया जाता है। | एडेनोसिन 5' फॉस्फोसल्फेट (APS) और लूसिफ़ेरिन का उपयोग किया जाता है। |
| अधिकतम तापमान | |
| यह एक धीमी प्रक्रिया है। | यह एक तेज़ प्रक्रिया है। |
सारांश – सेंगर सीक्वेंसिंग बनाम पाइरोडिंग
सेंगर अनुक्रमण और पाइरोडिंग दो डीएनए अनुक्रमण विधियाँ हैं जिनका उपयोग आणविक जीव विज्ञान में किया जाता है। सेंगर अनुक्रमण श्रृंखला बढ़ाव को समाप्त करके न्यूक्लियोटाइड के क्रम का निर्माण करता है जबकि पाइरोडिंग न्यूक्लियोटाइड्स को शामिल करके और पाइरोफॉस्फेट की रिहाई का पता लगाकर अनुक्रम में न्यूक्लियोटाइड के सटीक क्रम का निर्माण करता है।इसलिए, सेंगर अनुक्रमण और पाइरोडिंग के बीच मुख्य अंतर यह है कि सेंगर अनुक्रमण श्रृंखला समाप्ति द्वारा अनुक्रमण पर काम करता है जबकि पाइरोडिंग संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण पर काम करता है।
