मुख्य अंतर – आरटी पीसीआर बनाम क्यूपीसीआर
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन एक तकनीक है जिसका उपयोग इन विट्रो में डीएनए के एक विशिष्ट क्षेत्र को बढ़ाने के लिए किया जाता है। 1983 में कैरी मुलिस द्वारा इस तकनीक के आविष्कार के कारण, वैज्ञानिक अनुसंधान उद्देश्यों के लिए विशिष्ट डीएनए अंशों की हजारों से लाखों प्रतियां बनाने में सक्षम हैं। वर्तमान में यह विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए नैदानिक और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में एक सामान्य और नियमित रूप से निष्पादित तकनीक बन गई है। पारंपरिक पीसीआर तकनीक जैसे आरटी पीसीआर, नेस्टेड पीसीआर, मल्टीप्लेक्स पीसीआर, क्यू पीसीआर, आरटी - क्यूपीसीआर, आदि के रूपांतर हैं। आरटी पीसीआर और क्यू पीसीआर पीसीआर के दो महत्वपूर्ण रूपांतर हैं। आरटी पीसीआर और क्यू पीसीआर के बीच महत्वपूर्ण अंतर यह है कि आरटी पीसीआर का उपयोग आरएनए से पूरक डीएनए (सीडीएनए) टेप के निर्माण के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है जबकि क्यू पीसीआर का उपयोग फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों को वास्तविक समय में मात्रात्मक रूप से मापने के लिए किया जाता है।
आरटी पीसीआर क्या है?
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी पीसीआर) पीसीआर का एक प्रकार है जिसका उपयोग आरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह ऊतकों में एमआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण तरीका है। आरटी पीसीआर का उपयोग तब किया जाता है जब नमूने की प्रारंभिक सामग्री आरएनए होती है। RT PCR में, टेम्प्लेट mRNA को पहले पूरक डीएनए में परिवर्तित किया जाता है। यह चरण एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा उत्प्रेरित होता है और इस प्रक्रिया को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के रूप में जाना जाता है। दूसरे, पारंपरिक पीसीआर को प्रवर्धन के लिए नए संश्लेषित सीडीएनए के लिए नियोजित किया जाता है।
RT PCR एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है जिसके लिए अपेक्षाकृत कम मात्रा में RNA नमूने की आवश्यकता होती है। RT PCR का उपयोग आमतौर पर RNA प्रजातियों के निदान और परिमाणीकरण में किया जाता है, विशेष रूप से RNA वायरस जैसे मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस और हेपेटाइटिस C वायरस।
चित्र 01: आरटी पीसीआर तकनीक
क्यूपीसीआर क्या है?
मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) पीसीआर का एक प्रकार है जिसका उपयोग पीसीआर उत्पादों को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए किया जाता है। इसे रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के रूप में भी जाना जाता है क्योंकि यह रीयल टाइम पीसीआर मशीन का उपयोग करके वास्तविक समय के प्रवर्धन को मापता है। यह एक नमूने में मौजूद लक्ष्य अनुक्रम या जीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उपयुक्त तरीका है। QPCR की दिलचस्प विशेषता यह है कि यह प्रवर्धन और वास्तविक परिमाणीकरण दोनों को एक ही चरण में जोड़ती है। इसलिए, क्यूपीसीआर तकनीक द्वारा पता लगाने में जेल वैद्युतकणसंचलन की आवश्यकता को समाप्त किया जा सकता है। पीसीआर प्रतिक्रियाओं के दौरान पीसीआर उत्पादों को लेबल करने के लिए क्यूपीसीआर फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करता है जो अंततः प्रत्यक्ष परिमाणीकरण की ओर ले जाता है। जब पीसीआर उत्पाद जमा होते हैं, तो फ्लोरोसेंट सिग्नल भी जमा होते हैं और इसे रीयल टाइम मशीन द्वारा मापा जाएगा। QPCR को RT PCR के साथ जोड़ा जा सकता है। इसे आरटी - क्यूपीसीआर या क्यूआरटी - पीसीआर के रूप में जाना जाता है और इसे कोशिकाओं या ऊतकों में आरएनए स्तरों का पता लगाने के लिए सबसे शक्तिशाली, संवेदनशील और मात्रात्मक विधि माना जाता है।
एसवाईबीआर ग्रीन और ताकमान वास्तविक समय पीसीआर की प्रवर्धन प्रक्रिया का पता लगाने या देखने के लिए नियोजित दो तरीके हैं। SYBR ग्रीन विधि को SYBR ग्रीन नामक एक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके किया जाता है और डबल फंसे डीएनए का उत्पादन करने के लिए डाई को बांधकर प्रवर्धन का पता लगाता है। ताकमान को दोहरे लेबल वाली जांच का उपयोग करके किया जाता है और टाक पोलीमरेज़ द्वारा जांच के क्षरण और फ्लोरोफोर के रिलीज द्वारा प्रवर्धन का पता लगाता है जैसा कि चित्र 02 में दिखाया गया है। दोनों विधियाँ प्रवर्धन प्रक्रिया की प्रगति की निगरानी करती हैं और उत्पाद की वास्तविक समय की मात्रा की रिपोर्ट करती हैं।.
रीयल टाइम पीसीआर में जीन एक्सप्रेशन क्वांटिफिकेशन, माइक्रोआरएनए और नॉनकोडिंग आरएनए विश्लेषण, एसएनपी जीनोटाइपिंग, कॉपी नंबर वेरिएंट का पता लगाना, दुर्लभ म्यूटेशन का पता लगाना, आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों का पता लगाना, संक्रामक एजेंटों का पता लगाना जैसे विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोग हैं।, आदि
चित्र 02: मात्रात्मक पीसीआर तकनीक
आरटी पीसीआर और क्यूपीसीआर में क्या अंतर है?
आरटी पीसीआर बनाम क्यूपीसीआर |
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| RT PCR एक ऐसी तकनीक है जिसका उपयोग जीन एक्सप्रेशन को एम्प्लीफिकेशन द्वारा पता लगाने के लिए किया जाता है। | QPCR एक ऐसी तकनीक है जो डीएनए को बढ़ाती है और वास्तविक समय में पीसीआर उत्पादों की मात्रा निर्धारित करती है। |
| रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम का समावेश | |
| आरटी पीसीआर के लिए एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग किया जाता है। | QPCR के लिए एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग नहीं किया जाता है। |
| प्रतिदीप्त लेबल वाले अणुओं का उपयोग | |
| फ्लोरोसेंटली लेबल वाले डाई या प्रोब का उपयोग RT PCR के लिए नहीं किया जाता है। | QPCR के लिए फ्लोरोसेंट लेबल वाले डाई या प्रोब का उपयोग किया जाता है। |
| पीसीआर उत्पाद की मात्रा | |
| जब तक क्यूपीसीआर के साथ युग्मित नहीं किया जाता है, आरटी पीसीआर पीसीआर उत्पाद की मात्रा निर्धारित नहीं करता है। | QPCR मात्रात्मक रूप से पीसीआर उत्पाद को मापता है। |
| शुरुआती सामग्री | |
| प्रारंभिक सामग्री mRNA है। | प्रारंभिक सामग्री डीएनए है। |
| सीडीएनए का संश्लेषण | |
| आरटी पीसीआर के दौरान पूरक डीएनए का निर्माण होता है। | QPCR के दौरान पूरक डीएनए नहीं बनता है। |
सारांश – आरटी पीसीआर बनाम क्यूपीसीआर
RT PCR और QPCR पारंपरिक PCR के दो संस्करण हैं। आरटी पीसीआर तकनीक एमआरएनए नमूनों के लिए की जाती है और यह रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और सीडीएनए के उत्पादन द्वारा संचालित होती है।QPCR का उपयोग फ्लोरोसेंट डाई या लेबल प्रोब का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर थर्मल चक्रों के दौरान पीसीआर उत्पादों की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। QPCR में, PCR उत्पाद की मात्रा को नमूने द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेतों द्वारा दर्शाया जाता है। RT PCR लोकप्रिय रूप से एक प्रवर्धन प्रक्रिया के रूप में उपयोग किया जाता है जबकि QPCR आमतौर पर एक परिमाणीकरण प्रक्रिया के रूप में उपयोग किया जाता है। आरटी पीसीआर और क्यूपीसीआर में यही अंतर है।
