मुख्य अंतर - पीसीआर बनाम डीएनए अनुक्रमण
पीसीआर और डीएनए अनुक्रमण आणविक जीव विज्ञान में दो महत्वपूर्ण तकनीकें हैं। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) वह प्रक्रिया है जो डीएनए टुकड़े की बड़ी संख्या में प्रतियां बनाती है। डीएनए अनुक्रमण वह तकनीक है जिसके परिणामस्वरूप किसी दिए गए डीएनए टुकड़े के न्यूक्लियोटाइड का सटीक क्रम होता है। यह पीसीआर और डीएनए अनुक्रमण के बीच महत्वपूर्ण अंतर है। पीसीआर डीएनए अनुक्रमण में शामिल प्रमुख चरणों में से एक है।
पीसीआर क्या है?
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक डीएनए एम्प्लीफिकेशन तकनीक है जिसका इस्तेमाल मॉलिक्यूलर बायोलॉजी में किया जाता है। यह एक विशेष डीएनए टुकड़े की हजारों से लाखों प्रतियां तैयार करता है।इस विधि को 1983 में कैरी मुलिस द्वारा विकसित किया गया था। इस तकनीक में, डीएनए का टुकड़ा जिसे बढ़ाया जाना है, टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है और डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम प्राइमर में पूरक न्यूक्लियोटाइड जोड़ता है जो पीसीआर मिश्रण में उपलब्ध है। पीसीआर प्रतिक्रिया के अंत में, नमूना डीएनए की कई प्रतियां संश्लेषित की जाती हैं।
पीसीआर मिश्रण के विभिन्न घटक होते हैं, जिनमें डीएनए, डीएनए पोलीमरेज़ (टाक पोलीमरेज़), प्राइमर (फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर), न्यूक्लियोटाइड्स (डीएनए के बिल्डिंग ब्लॉक्स) और एक बफर शामिल हैं। पीसीआर एक पीसीआर मशीन के अंदर होता है, और सही पीसीआर मिश्रण को मशीन में लोड किया जाना चाहिए, और सही प्रोग्राम चलाया जाना चाहिए। यह तकनीक डीएनए के एक विशेष खंड की बहुत कम मात्रा में डीएनए से हजारों से लाखों प्रतियों का उत्पादन करने में सक्षम बनाती है।
पीसीआर प्रतिक्रियाएं एक जेल पर पीसीआर उत्पादों की दृश्यमान मात्रा का उत्पादन करने के लिए चक्रीय तरीके से होती हैं। पीसीआर प्रतिक्रिया में तीन प्रमुख चरण शामिल हैं, जैसे कि विकृतीकरण, प्राइमर एनीलिंग और स्ट्रैंड एक्सटेंशन जैसा कि चित्र 01 में दिखाया गया है।ये तीन चरण तीन अलग-अलग तापमानों पर हो रहे हैं। पूरक आधारों के बीच हाइड्रोजन बांड द्वारा डीएनए दोहरे फंसे हुए रूप में मौजूद है। निहितार्थ से पहले, डबल फंसे डीएनए को एक दूसरे से अलग किया जाना चाहिए। यह उच्च तापमान देकर किया जाता है। उच्च तापमान पर, डबल स्ट्रैंडेड डीएनए एकल स्ट्रैंड में विकृत हो जाता है। फिर प्राइमरों को डीएनए के विशिष्ट टुकड़े या जीन के फ्लैंकिंग सिरों के करीब आना चाहिए। प्राइमर एकल-फंसे डीएनए का एक छोटा टुकड़ा है जो लक्ष्य अनुक्रम का पूरक है। फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर एनीलिंग तापमान पर विकृत नमूना डीएनए के फ्लैंकिंग सिरों पर पूरक आधारों के साथ एनील करते हैं। प्राइमर गर्मी प्रतिरोधी होना चाहिए। एक बार जब प्राइमर नमूना डीएनए के साथ जुड़ जाते हैं, तो टाक पोलीमरेज़ एंजाइम न्यूक्लियोटाइड जोड़कर नए स्ट्रैंड के संश्लेषण की शुरुआत करता है जो लक्ष्य डीएनए के पूरक होते हैं। टाक पोलीमरेज़ एक ऊष्मा स्थिर एंजाइम है जो थर्मस एक्वाटिकस नामक थर्मोफिलिक जीवाणु से पृथक होता है। पीसीआर बफर टाक पोलीमरेज़ कार्रवाई के लिए इष्टतम स्थितियों को बनाए रखता है।पीसीआर प्रतिक्रियाओं के इन तीन चरणों को पीसीआर उत्पाद की आवश्यक मात्रा का उत्पादन करने के लिए दोहराया जाता है। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के बाद, डीएनए कॉपी की संख्या दोगुनी हो जाती है। इसलिए, पीसीआर में एक घातीय प्रवर्धन देखा जा सकता है। पीसीआर उत्पादों को जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके देखा जा सकता है और आगे के अध्ययन के लिए शुद्ध किया जा सकता है।
चित्र 01: पीसीआर प्रतिक्रिया के प्रमुख चरण
पीसीआर चिकित्सा और जैविक अनुसंधान में एक मूल्यवान उपकरण है। फोरेंसिक विज्ञान में पीसीआर का विशेष महत्व है क्योंकि यह अपराधियों के छोटे नमूनों के अध्ययन के लिए डीएनए को बढ़ा सकता है और फोरेंसिक डीएनए प्रोफाइल बना सकता है। पीसीआर का व्यापक रूप से आणविक जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है, जिसमें जीनोटाइपिंग, जीन क्लोनिंग, म्यूटेशन डिटेक्शन, डीएनए सीक्वेंसिंग, डीएनए माइक्रोएरे और पितृत्व परीक्षण आदि शामिल हैं।
चित्र 02: पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
डीएनए अनुक्रमण क्या है?
डीएनए अनुक्रमण किसी दिए गए डीएनए टुकड़े में न्यूक्लियोटाइड्स - एडेनिन, ग्वानिन, साइटोसिन और थाइमिन के एक सटीक क्रम का निर्धारण है। न्यूक्लियोटाइड के सही क्रम का उपयोग करके आनुवंशिक जानकारी को डीएनए अनुक्रमों में संग्रहीत किया जाता है। इसलिए, डीएनए के टुकड़े में न्यूक्लियोटाइड के सटीक क्रम का पता लगाना जीन की संरचना और कार्य के बारे में जानना बहुत महत्वपूर्ण है।
डीएनए अनुक्रमण प्रोटोकॉल में विभिन्न प्रक्रियाएं शामिल हैं। पहला कदम किसी जीव के इच्छुक डीएनए या जीनोमिक डीएनए का अलगाव है। पीसीआर का उपयोग करना (जैसा कि ऊपर वर्णित है), डीएनए के वांछित क्षेत्र को बढ़ाया जाना चाहिए। प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद को जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाना चाहिए और शुद्ध किया जाना चाहिए। प्रवर्धित अंशों को अनुक्रमण के लिए टेम्पलेट के रूप में परोसा जाता है।अनुक्रमण या तो सेंगर अनुक्रमण या उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण विधि का पालन करके किया जा सकता है। सेंगर अनुक्रमण के लिए परिणामी डीएनए अंशों के केशिका वैद्युतकणसंचलन की आवश्यकता होती है। सही न्यूक्लियोटाइड क्रम का निर्धारण ऑटोरेडियोग्राफ के मैनुअल रीडिंग या स्वचालित डीएनए सीक्वेंसर का उपयोग करके किया जा सकता है।
जीन अनुक्रमण ने मानव जीनोम परियोजना में योगदान दिया और 2003 में मानव जीनोम के मानचित्रण की सुविधा प्रदान की। फोरेंसिक में, डीएनए अनुक्रमण ने उन व्यक्तियों की पहचान को सक्षम किया जो अद्वितीय डीएनए अनुक्रम दिखाते हैं और अपराधियों की पहचान करते हैं। चिकित्सा में, आनुवंशिक और अन्य बीमारियों के लिए जिम्मेदार जीन का पता लगाने के लिए डीएनए अनुक्रमण का उपयोग किया जा सकता है, दोष वाले जीन का पता लगाया जा सकता है और उन्हें सही जीन के साथ बदल दिया जा सकता है। कृषि में, कुछ सूक्ष्मजीवों की डीएनए अनुक्रमण जानकारी का उपयोग आर्थिक रूप से वांछित विशेषताओं के साथ ट्रांसजेनिक फसलों के उत्पादन के लिए किया जाता है।
चित्र 03: डीएनए अनुक्रमण
पीसीआर और डीएनए सीक्वेंसिंग में क्या अंतर है?
पीसीआर बनाम डीएनए अनुक्रमण |
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| पीसीआर प्रक्रिया इच्छुक डीएनए टुकड़े की हजारों से लाखों प्रतियां बनाती है। | डीएनए अनुक्रमण किसी दिए गए डीएनए टुकड़े में न्यूक्लियोटाइड के सटीक क्रम को निर्धारित करने की प्रक्रिया है। |
| परिणाम | |
| पीसीआर एक विशेष डीएनए टुकड़े की हजारों से लाखों प्रतियां बनाता है | इसका परिणाम एक विशेष डीएनए खंड में आधारों के सही क्रम में होता है। |
| डीडीएनटीपी की भागीदारी | |
| पीसीआर को डीडीएनटीपी की आवश्यकता नहीं है। यह dNTPs का उपयोग करता है। | डीएनए अनुक्रमण के लिए स्ट्रैंड गठन को समाप्त करने के लिए ddNTPs की आवश्यकता होती है। |
सारांश – पीसीआर बनाम डीएनए अनुक्रमण
आणविक जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में पीसीआर और डीएनए अनुक्रमण बहुत महत्वपूर्ण उपकरण हैं। डीएनए टुकड़े का प्रवर्धन पीसीआर तकनीक द्वारा किया जाता है जबकि डीएनए टुकड़े के न्यूक्लियोटाइड का सही क्रम डीएनए अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया जाता है। पीसीआर और डीएनए अनुक्रमण के बीच यही अंतर है।
