मुख्य अंतर – SYBR ग्रीन बनाम तकमान
एसवाईबीआर ग्रीन और ताकमान रीयल-टाइम पीसीआर की प्रवर्धन प्रक्रिया का पता लगाने या देखने के लिए नियोजित दो तरीके हैं। SYBR ग्रीन एक विधि है जो न्यूक्लिक एसिड धुंधला डाई को जोड़ने पर आधारित है जबकि ताकमान हाइड्रोलिसिस जांच पर आधारित एक विधि है। दोनों प्रौद्योगिकियों को पीसीआर के दौरान फ्लोरोसेंस उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो रीयल-टाइम पीसीआर मशीन को "वास्तविक समय" में प्रतिक्रिया की निगरानी करने की अनुमति देता है। SYBR ग्रीन विधि को SYBR ग्रीन नामक एक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके किया जाता है और डाई को डबल स्ट्रैंडेड डीएनए के उत्पादन के लिए बाध्य करके प्रवर्धन का पता लगाता है। ताकमान को दोहरे लेबल वाली जांच का उपयोग करके किया जाता है और टैक पोलीमरेज़ द्वारा जांच के क्षरण और फ्लोरोफोर के रिलीज द्वारा प्रवर्धन का पता लगाता है।यह SYBR ग्रीन और ताकमान के बीच महत्वपूर्ण अंतर है।
एसवाईबीआर ग्रीन क्या है?
SYBR ग्रीन एक फ्लोरोसेंट डाई है जिसका उपयोग न्यूक्लिक एसिड को दागने के लिए किया जाता है, विशेष रूप से आणविक जीव विज्ञान में डबल फंसे डीएनए। वास्तविक समय पीसीआर के दौरान पीसीआर उत्पादों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एसवाईबीआर ग्रीन विधि का उपयोग किया जाता है। एक बार जब यह डीएनए से जुड़ जाता है, तो परिणामी डीएनए-डाई कॉम्प्लेक्स नीली रोशनी को अवशोषित करता है और तीव्र हरी रोशनी का उत्सर्जन करता है। यह डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के साथ बंधने पर डाई अणु में होने वाले संरचनात्मक परिवर्तन के कारण होता है। जब पीसीआर अधिक से अधिक डीएनए बनाता है, तो अधिक डाई अणु डीएनए के साथ जुड़ जाते हैं, जिससे अधिक प्रतिदीप्ति उत्पन्न होती है। इसलिए, पीसीआर उत्पाद संचय के साथ प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है। इसलिए, पीसीआर उत्पाद की मात्रा को एसवाईबीआर ग्रीन फ्लोरोसेंस डिटेक्शन द्वारा मात्रात्मक रूप से मापा जा सकता है।
एसवाईबीआर ग्रीन डाई का उपयोग साइटोमेट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में डीएनए लेबलिंग के लिए भी किया जा सकता है। एथिडियम ब्रोमाइड को एसवाईबीआर ग्रीन द्वारा सफलतापूर्वक बदल दिया गया है क्योंकि एथिडियम ब्रोमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन में डीएनए विज़ुअलाइज़ेशन के दौरान निपटान समस्याओं के साथ एक कार्सिनोजेनिक डाई है।
एसवाईबीआर ग्रीन मेथड के फायदे और नुकसान हैं। यह विधि बहुत संवेदनशील, सस्ती और उपयोग में आसान है। हालांकि, किसी भी डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए से जुड़ने की इसकी क्षमता के कारण, गैर-विशिष्ट बंधन पीसीआर उत्पाद की अधिक मात्रा का कारण बन सकता है।
चित्र 01: SYBR ग्रीन तकनीक
ताकमान क्या है?
तकमान वास्तविक समय पीसीआर प्रक्रिया की निगरानी के लिए एसवाईबीआर ग्रीन का एक वैकल्पिक तरीका है। यह विधि नए स्ट्रैंड के विस्तार और फ्लोरोफोर की रिहाई के दौरान जांच को नीचा दिखाने के लिए टैक पोलीमरेज़ एंजाइम की 5 '-3' एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि पर निर्भर करती है। इस पद्धति में दोहरे लेबल वाली जांच का उपयोग किया जाता है और यह जांच के हाइड्रोलिसिस पर आधारित है। प्रोब फ्लोरोसेंटली लेबल वाले डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स होते हैं जिनमें 5 'अंत में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अणु (फ्लोरोफोर) और 3' छोर पर एक क्वेंचर अणु होता है।वे प्राइमर एनील्स के विपरीत दिशा में एकल फंसे हुए टेम्पलेट से जुड़ने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। टाक पोलीमरेज़ प्राइमर में न्यूक्लियोटाइड जोड़ता है और नए स्ट्रैंड को दोहरे लेबल वाले जांच की ओर बढ़ाता है। एक बार जब टाक पोलीमरेज़ जांच से मिल जाता है, तो टाक पोलीमरेज़ की एक्सोन्यूक्लिज़ क्रिया सक्रिय हो जाती है और जांच को ख़राब कर देती है। एक बार जब यह नए स्ट्रैंड के संश्लेषण को पूरा कर लेता है, तो जांच पूरी तरह से खराब हो जाती है और फ्लोरोफोर को छोड़ देती है। फ्लोरोफोर की रिहाई प्रतिदीप्ति उत्पन्न करती है। फ्लोरोसेंट क्वेंचर अणु उत्सर्जित प्रकाश को कुशलता से बुझाता है और पीसीआर उत्पाद की मात्रा का ठहराव के लिए आउटपुट बनाता है। फ्लोरोफोर्स की रिहाई और पीसीआर उत्पादों की मात्रा आनुपातिक हैं। इसलिए, तकमान विधि द्वारा परिमाणीकरण आसानी से किया जा सकता है।
चित्र 02: तकमान विधि
तकमान पद्धति का उपयोग वास्तविक समय पीसीआर, जीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव, आनुवंशिक बहुरूपताओं का पता लगाने, गुणसूत्र डीएनए विलोपन की मात्रा का ठहराव, जीवाणु पहचान, माइक्रोएरे विश्लेषण का सत्यापन, एसएनपी जीनोटाइपिंग आदि में किया जाता है।
एसवाईबीआर ग्रीन और तकमान में क्या अंतर है?
एसवाईबीआर ग्रीन बनाम तकमान |
|
| एसवाईबीआर ग्रीन डीएनए बाइंडिंग डाई पर आधारित है। | ताकमान संकरण जांच पर निर्भर करता है और टाक पोलीमरेज़ की 5' से 3' एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि। |
| फ्लोरोसेंटली लेबल जांच | |
| फ्लोरोसेंटली लेबल वाली जांच की आवश्यकता नहीं है। | दोहरे लेबल वाले जांच की आवश्यकता है। |
| मल्टीप्लेक्स जीन विश्लेषण | |
| इसका उपयोग मल्टीप्लेक्स जीन लक्ष्य के लिए नहीं किया जा सकता है। | इसका उपयोग मल्टीप्लेक्स जीन लक्ष्यों के लिए किया जा सकता है। |
| लागत | |
| यह कम खर्चीला है। | यह अधिक महंगा है। |
| विशिष्टता | |
| यह कम विशिष्ट है और किसी भी डबल स्ट्रैंड डीएनए के साथ बांधता है | ये अत्यधिक विशिष्ट हैं क्योंकि जांच विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादों का पता लगाती है। |
| प्रभावकारिता | |
| यह कम प्रभावी है। | यह अत्यधिक प्रभावी है। |
| आवेदन | |
| इसका उपयोग रीयल-टाइम पीसीआर, agarose gel विज़ुअलाइज़ेशन, डीएनए लेबलिंग आदि में किया जाता है। | इसका उपयोग वास्तविक समय पीसीआर, जीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव, आनुवंशिक बहुरूपताओं का पता लगाने आदि में किया जाता है। |
सारांश – SYBR ग्रीन और तकमान
ताकमान और एसवाईबीआर ग्रीन रीयल-टाइम पीसीआर (मात्रात्मक पीसीआर) में नियोजित दो तरीके हैं। दोनों विधियां पीसीआर उत्पाद के परिमाणीकरण को कुशलतापूर्वक सक्षम करती हैं और फ्लोरेसेंस के उत्सर्जन पर निर्भर करती हैं। तक्मान विधि संचित डीएनए का पता लगाने के लिए दोहरे लेबल वाली जांच का उपयोग करती है जबकि एसवाईबीआर ग्रीन विधि एक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करती है। इन दोनों विधियों के आणविक जीव विज्ञान में भी अलग-अलग अनुप्रयोग हैं।
